Testy anti-Xa: tylko jeden równoważny z LC-MS/MS dla riwaroksabanu

Czy testy anti-Xa są wystarczająco dokładne w pomiarze inhibitorów czynnika Xa?

Riwaroksaban i apiksaban to bezpośrednie doustne inhibitory czynnika Xa (DXI) szeroko stosowane w profilaktyce i leczeniu zaburzeń zakrzepowych. Chociaż terapia DXI nie wymaga rutynowego monitorowania laboratoryjnego, pomiar stężenia tych leków w osoczu może mieć kluczowe znaczenie kliniczne w określonych sytuacjach – na przykład przed pilnymi zabiegami chirurgicznymi, w przypadku ciężkich krwawień lub u pacjentów z zaburzeniami czynności nerek.

Metoda referencyjna oznaczania stężeń DXI to chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas tandemowych (LC-MS/MS), jednak technika ta nie jest powszechnie dostępna w większości laboratoriów klinicznych. Alternatywą są chromogeniczne testy anti-Xa kalibrowane znanymi stężeniami DXI. Dotychczasowe badania wykazywały wysokie współczynniki korelacji między stężeniami DXI a aktywnością anti-Xa, co wspierało ich szerokie zastosowanie w praktyce. Należy jednak pamiętać, że silna korelacja nie oznacza równoważności metod – laboratoria muszą weryfikować zgodność testów przed wdrożeniem klinicznym.

Szczególnie istotna jest wydajność testów w okolicach progów decyzyjnych: u pacjentów z ciężkim krwawieniem podanie antidotum zaleca się przy stężeniu leku powyżej 50 ng/mL, natomiast przed pilnymi zabiegami z wysokim ryzykiem krwawienia próg wynosi 30 ng/mL. Ponieważ testy anti-Xa nie są standaryzowane i wykazują znaczną zmienność międzymetodową, nie można zakładać ich równoważności z LC-MS/MS bez odpowiedniej walidacji.

Co było celem tego wieloośrodkowego badania?

Celem tego wieloośrodkowego badania była ocena równoważności różnych testów anti-Xa z referencyjną metodą LC-MS/MS w pomiarze stężeń riwaroksabanu i apiksabanu, ze szczególnym uwzględnieniem wydajności w okolicach klinicznych progów decyzyjnych 50 i 30 ng/mL. Dodatkowo badacze ocenili potencjalną użyteczność rozcieńczonego czasu jadu węża Russella (dRVVT) jako szybkiego narzędzia przesiewowego w sytuacjach nagłych.

Do badania włączono 122 pacjentów z migotaniem przedsionków: 60 leczonych riwaroksabanem (30 otrzymywało 20 mg dziennie, 30 otrzymywało 15 mg dziennie) i 62 leczonych apiksabanem (32 otrzymywało 5 mg dwa razy dziennie, 30 otrzymywało 2,5 mg dwa razy dziennie). Od każdego pacjenta pobierano trzy próbki w stężeniu minimalnym (12 ± 1,5 h po ostatniej dawce apiksabanu i 24 ± 1 h po ostatniej dawce riwaroksabanu) oraz trzy próbki w stężeniu szczytowym (124 ± 8 min po podaniu leku) w okresie 6–8 tygodni. Łącznie przeanalizowano 358 próbek z riwaroksabanem i 366 próbek z apiksabanem.

Jakie metody analityczne porównano w badaniu?

Stężenia riwaroksabanu i apiksabanu mierzono metodą LC-MS/MS z dolną granicą wykrywalności 2 ng/mL. W trzech uczestniczących ośrodkach (University Medical Centre Ljubljana, Karolinska Institute, University Hospital Centre Zagreb) przeprowadzono pomiary różnymi testami anti-Xa, wykorzystując różne kombinacje odczynników, kalibratorów, kontroli i analizatorów.

Badane testy anti-Xa obejmowały: Berichrom Heparin (z modyfikacją – bez dodawania egzogennej antytrombiny), Innovance Heparin (w dwóch laboratoriach z różnymi kalibratorami), STA-Liquid Anti-Xa (w dwóch laboratoriach), DiXaI, HemosIL Liquid Anti-Xa, Heparin LRT oraz Technochrom anti-Xa/Heparin. Wszystkie testy przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, z wyjątkiem Berichrom Heparin, gdzie zastosowano bufor zamiast antytrombiny.

Dodatkowo we wszystkich trzech ośrodkach wykonano test dRVVT przy użyciu LA 2 Confirmation Reagent (Siemens Healthineers) na analizatorach z rodziny CS. W jednym laboratorium zmierzono także czas kaolinowo-kefalinowy (APTT) odczynnikiem Pathromtin SL.

Zgodność między metodami oceniano za pomocą wykresów Blanda-Altmana oraz analizy regresji Passing-Bablok, która pozwoliła określić obciążenie proporcjonalne i stałe. Równoważność metod definiowano jako brak obciążenia proporcjonalnego (95% CI dla współczynnika nachylenia regresji zawierało 1) i brak obciążenia stałego (95% CI dla przecięcia zawierało 0).

Jak testy anti-Xa radziły sobie z pomiarem riwaroksabanu?

Dla riwaroksabanu średnie różnice między testami anti-Xa a LC-MS/MS wahały się od -12 ng/mL (HemosIL Liquid) do +10 ng/mL (Heparin LRT). Najszersze granice zgodności zaobserwowano dla Heparin LRT (od -94 do +114 ng/mL), co wskazuje na niższą dokładność i wiarygodność tego testu.

Analiza Passing-Bablok wykazała, że tylko test Berichrom osiągnął równoważność z LC-MS/MS, ze współczynnikiem nachylenia regresji 0,99 (95% CI: 0,96–1,01) i przecięciem -0,84 (95% CI: -2,25 do 0,63). Test Innovance (Lab. A) i Heparin LRT przeszacowywały stężenia riwaroksabanu, wykazując obciążenie proporcjonalne około 10%. Wszystkie pozostałe testy, z wyjątkiem Berichrom i Heparin LRT, wykazywały obciążenie stałe w zakresie od -7,4 do +24,2 ng/mL.

Szczególnie niepokojące było wyraźne obciążenie proporcjonalne przy niskich stężeniach riwaroksabanu (<50 ng/mL) dla testów Innovance (Lab. C) i Technochrom – oba kalibrowane kalibratorami Technoclone. Testy te przeszacowywały stężenia riwaroksabanu przy klinicznie istotnych progach decyzyjnych, co może prowadzić do błędnych decyzji klinicznych.

Z drugiej strony, testy STA-Liquid (Lab. B), DiXaI i HemosIL niedoszacowywały riwaroksabanu przy progach klinicznych. Najniższe wartości uzyskano testem HemosIL (95% CI: 20–24 ng/mL przy rzeczywistym stężeniu 30 ng/mL i 40–43 ng/mL przy 50 ng/mL). Tylko STA-Liquid (Lab. A) i Berichrom zapewniały wiarygodne wyniki przy obu progach decyzyjnych.

Dlaczego pomiar apiksabanu okazał się bardziej problematyczny?

W przeciwieństwie do riwaroksabanu, wszystkie testy anti-Xa istotnie niedoszacowywały stężenia apiksabanu. Średnie różnice wahały się od -49 ng/mL (Technochrom) do -24 ng/mL (Berichrom). Najszersze granice zgodności zaobserwowano dla Berichrom (od -87 do +39 ng/mL) i Technochrom (od -110 do 13 ng/mL).

Analiza Passing-Bablok wykazała, że wszystkie testy wykazywały obciążenie proporcjonalne w zakresie 10–20%, a dodatkowo testy Berichrom, Innovance (Lab. C), Heparin LRT i Technochrom wykazywały również obciążenie stałe między -17,8 a +13,9 ng/mL. Żaden z testów nie osiągnął równoważności z LC-MS/MS dla apiksabanu.

To niedoszacowanie stwarza poważne ryzyko kliniczne: pacjenci mogą być poddawani zabiegom inwazyjnym lub odmówiono im podania antidotum na podstawie fałszywie niskich wyników. W skrajnych przypadkach zmierzone stężenia apiksabanu stanowiły tylko połowę rzeczywistych wartości – na przykład test wskazywał 75 ng/mL, podczas gdy rzeczywiste stężenie wynosiło 150 ng/mL.

Autorzy badania podkreślają, że różnice w składzie kalibratorów, partiach odczynników i typach analizatorów mogą przyczyniać się do zmienności analitycznej. Brak międzynarodowego standardu referencyjnego dla apiksabanu uniemożliwia zapewnienie identycznej charakterystyki wszystkich używanych kalibratorów. Programy zewnętrznej kontroli jakości (INSTAND, ECAT) potwierdzają, że zgłaszane stężenia DXI różnią się w zależności od kombinacji odczynnik-analizator.

Czy dRVVT może zastąpić testy anti-Xa w sytuacjach nagłych?

Test dRVVT wykazywał silną korelację ze stężeniami riwaroksabanu we wszystkich trzech uczestniczących laboratoriach – silniejszą niż APTT. Dla apiksabanu współczynniki korelacji były konsekwentnie niższe niż dla riwaroksabanu we wszystkich ośrodkach, a najsłabszą korelację zaobserwowano między stężeniem apiksabanu a APTT.

Jednak pomimo silnej korelacji, dRVVT nie był konsekwentnie wydłużony przy klinicznie istotnych stężeniach. Stałe wydłużenie dRVVT powyżej górnej granicy normy (>35,5 s) obserwowano dopiero przy stężeniach riwaroksabanu przekraczających 28 ng/mL (Lab. A), 81 ng/mL (Lab. B) i 86 ng/mL (Lab. C), oraz przy stężeniach apiksabanu powyżej 70 ng/mL (Lab. A), 129 ng/mL (Lab. B) i 84 ng/mL (Lab. C).

Co więcej, pomimo stosowania tego samego odczynnika i rodziny analizatorów, wyniki dRVVT nie były równoważne między laboratoriami ani dla riwaroksabanu, ani dla apiksabanu. Zmienność międzylaboratoryjna utrzymywała się prawdopodobnie z powodu braku kalibracji testu. Autorzy jednoznacznie stwierdzają: “dRVVT nie może być zalecany jako wiarygodna alternatywa dla szybkiej oceny DXI w sytuacjach nagłych”.

Co te wyniki oznaczają dla bezpieczeństwa pacjentów?

Wyniki tego badania mają bezpośrednie konsekwencje dla praktyki klinicznej i bezpieczeństwa pacjentów przyjmujących inhibitory czynnika Xa. Niezależnie od kombinacji odczynnika, kalibratora, kontroli czy analizatora, wszystkie testy anti-Xa szacowały stężenia riwaroksabanu dokładniej niż stężenia apiksabanu. Jednak tylko jeden test wykazał równoważność z metodą referencyjną LC-MS/MS dla riwaroksabanu.

Kilka testów zapewniało wiarygodne wyniki dla riwaroksabanu w okolicach klinicznie istotnych progów decyzyjnych, ale żaden nie spełniał tego kryterium dla apiksabanu. To niedoszacowanie stężeń apiksabanu może narazić pacjentów na zwiększone ryzyko krwawienia – problem wymagający pilnych dalszych badań klinicznych.

Autorzy zdecydowanie odradzają laboratoriom wyprowadzanie skorygowanych progów decyzyjnych na podstawie przedstawionych danych i wzywają producentów do poprawy standaryzacji lub harmonizacji testów anti-Xa. Zmienność analityczna wynikająca z różnic w składzie kalibratorów, partiach odczynników i typach analizatorów pozostaje niewystarczająco zbadana, mimo że programy zewnętrznej kontroli jakości potwierdzają znaczące różnice między metodami.

Kluczowe jest, aby laboratoria weryfikowały równoważność testów przed ich wdrożeniem klinicznym, szczególnie w kontekście progów decyzyjnych dotyczących podania antidotum czy kwalifikacji do pilnych zabiegów. Decyzje kliniczne oparte na niedokładnych pomiarach stężeń DXI mogą prowadzić do poważnych powikłań krwotocznych lub zakrzepowych.

Jakie są mocne strony i ograniczenia tego badania?

Do mocnych stron badania należy bezpośrednie porównanie z referencyjną metodą LC-MS/MS, duża liczba próbek od pacjentów z rutynowej praktyki klinicznej obejmujących szeroki zakres stężeń oraz włączenie wielu testów anti-Xa z różnymi kombinacjami kalibratorów, odzwierciedlających rzeczywiste warunki kliniczne.

Testowanie próbek osocza pacjentów uwzględnia zmienność biologiczną i patologiczną napotkaną w praktyce klinicznej, zapewniając realistyczną ocenę odporności testów. W przeciwieństwie do osocza referencyjnego, próbki pacjentów mogą zawierać substancje interferujące (leki, przeciwciała, białka), co pomaga identyfikować potencjalne ograniczenia testów. Co istotne, wyniki pochodzące od rzeczywistych pacjentów są bezpośrednio aplikowalne do podejmowania decyzji klinicznych.

Ograniczenia badania obejmują wykonanie pojedynczych pomiarów zamiast duplikatów dla wszystkich próbek – jednak przy tak dużej liczbie pomiarów prawdopodobieństwo pominięcia systematycznego obciążenia jest minimalne. Kolejnym ograniczeniem była znacznie mniejsza liczba próbek analizowanych odczynnikiem Technochrom (125 dla riwaroksabanu i 116 dla apiksabanu zamiast pełnej puli), co zmniejsza moc statystyczną wniosków dotyczących tego testu.

Jakie działania powinny podjąć laboratoria i klinicyści?

Niezależnie od używanej kombinacji odczynnika, kalibratora, kontroli czy analizatora, wszystkie testy anti-Xa szacowały stężenia riwaroksabanu dokładniej niż apiksabanu. Jednak tylko test Berichrom wykazał pełną równoważność z metodą referencyjną LC-MS/MS dla riwaroksabanu. Ponieważ Berichrom został wycofany z produkcji, na podstawie wyników tego badania najbardziej odpowiednią alternatywą wydaje się kombinacja Innovance Heparin z kalibratorem STA-Rivaroxaban na analizatorze CS-2500.

Wszystkie testy dla apiksabanu istotnie niedoszacowywały rzeczywiste stężenia, co stwarza ryzyko kliniczne – pacjenci mogą być poddawani zabiegom inwazyjnym lub odmówiono im antidotum na podstawie fałszywie niskich wyników. Ta obserwacja wymaga pilnego dalszego badania klinicznego skutków takiego niedoszacowania dla bezpieczeństwa pacjentów.

Test dRVVT, mimo prostoty wykonania i silnej korelacji ze stężeniami DXI, okazał się niewystarczająco czuły do wykrywania klinicznie istotnych stężeń riwaroksabanu i apiksabanu. Nie może zatem zastąpić testów anti-Xa w sytuacjach nagłych. Zmienność międzylaboratoryjna dRVVT, mimo stosowania identycznych odczynników i rodzin analizatorów, dodatkowo ogranicza jego zastosowanie.

Klinicyści powinni być świadomi, że wyniki testów anti-Xa mogą się znacząco różnić w zależności od używanej metody, szczególnie dla apiksabanu. Interpretując wyniki, należy uwzględniać charakterystykę używanego testu i jego wydajność przy klinicznie istotnych progach decyzyjnych. W przypadku wątpliwości lub krytycznych decyzji terapeutycznych warto rozważyć potwierdzenie wyników metodą LC-MS/MS, jeśli jest dostępna.

Co najważniejszego powinni zapamiętać specjaliści kardiologii i hematologii?

To wieloośrodkowe badanie porównawcze jednoznacznie wykazało, że testy anti-Xa nie są równoważne w pomiarze stężeń inhibitorów czynnika Xa. Tylko jeden test (Berichrom) osiągnął pełną zgodność z metodą referencyjną LC-MS/MS dla riwaroksabanu, podczas gdy żaden test nie spełnił tego kryterium dla apiksabanu. Wszystkie badane metody istotnie niedoszacowywały stężenia apiksabanu o 10–20%, co może prowadzić do błędnych decyzji klinicznych i narazić pacjentów na zwiększone ryzyko krwawienia.

Szczególnie niepokojące jest, że żaden z testów nie zapewniał wiarygodnych wyników dla apiksabanu w okolicach klinicznie istotnych progów decyzyjnych 30 i 50 ng/mL. W niektórych przypadkach zmierzone stężenia stanowiły zaledwie połowę rzeczywistych wartości. Laboratoria muszą zatem bezwzględnie weryfikować równoważność używanych testów z metodą referencyjną przed wdrożeniem do praktyki klinicznej, szczególnie gdy wyniki mają wpływać na decyzje o podaniu antidotum czy kwalifikacji do pilnych zabiegów.

Test dRVVT, mimo silnej korelacji ze stężeniami DXI, nie może zastąpić testów anti-Xa w sytuacjach nagłych ze względu na niewystarczającą czułość przy klinicznie istotnych stężeniach i znaczną zmienność międzylaboratoryjną. Producenci testów diagnostycznych muszą pilnie poprawić standaryzację lub harmonizację testów anti-Xa, a brak międzynarodowego standardu referencyjnego dla DXI pozostaje poważną przeszkodą w zapewnieniu wiarygodności pomiarów w różnych laboratoriach.

Klinicyści interpretujący wyniki testów anti-Xa u pacjentów przyjmujących apiksaban powinni zachować szczególną ostrożność, mając na uwadze systematyczne niedoszacowanie stężeń przez dostępne metody. W przypadku krytycznych decyzji terapeutycznych warto rozważyć potwierdzenie wyników metodą LC-MS/MS, jeśli jest dostępna, lub przyjąć bardziej konserwatywne podejście do interpretacji wyników testów anti-Xa.