Mikrobiota jelitowa a riwaroksaban: Allobaculum markerem odpowiedzi?

Czy mikrobiota jelitowa wpływa na odpowiedź na riwaroksaban?

Riwaroksaban – doustny antykoagulant z grupy NOAC (novel oral anticoagulant) – stanowi obecnie ponad 60% wartości rynkowej doustnych leków przeciwzakrzepowych w Chinach. Mimo szerokiego zastosowania w prewencji i leczeniu migotania przedsionków oraz zdarzeń zakrzepowo-zatorowych, obserwuje się znaczną międzyosobniczą zmienność skuteczności i interakcji lekowych. Nie wszystkie różnice można wyjaśnić farmakogenomiką, co skłania do poszukiwania nowych markerów odpowiedzi terapeutycznej.

Rosnąca liczba dowodów wskazuje, że indywidualna mikrobiota jelitowa odgrywa kluczową rolę w metabolizmie leków i odpowiedzi na terapię. Riwaroksaban jest metabolizowany głównie przez CYP3A, a międzyosobnicze różnice w składzie mikrobioty mogą wpływać na ekspresję tego enzymu oraz funkcję glikoproteiny P (P-gp). Chińscy naukowcy postanowili zbadać, czy i w jaki sposób podawanie riwaroksabanu w różnych dawkach modyfikuje mikrobiotę jelitową szczurów oraz jak te zmiany korelują z parametrami krzepnięcia.

Jak zaprojektowano eksperyment na modelu szczurzym?

Do badania włączono 24 samce szczurów Sprague–Dawley (wiek 6 tygodni, masa ciała 200–220 g), które losowo przydzielono do czterech grup po 6 zwierząt: grupa kontrolna (CGA, placebo – PBS) oraz trzy grupy eksperymentalne otrzymujące riwaroksaban w dawkach małej (EGAL, 0,9 mg/kg), średniej (EGAM, 2,7 mg/kg) i dużej (EGAH, 18 mg/kg). Dawki te odpowiadają w przybliżeniu ludzkim ekwiwalentom 10, 30 i 200 mg/dobę po przeliczeniu metodą BSA (body surface area).

Lek podawano doustnie (gavage) raz dziennie przez 30 dni. Najwyższa dawka (18 mg/kg) celowo przekraczała dawki terapeutyczne, aby zamodelować scenariusz przedawkowania/wysokiego narażenia i zmaksymalizować wykrywalne zmiany parametrów krzepnięcia oraz mikrobioty w zakresie tolerowanym przez szczury. Po zakończeniu 30-dniowego okresu pobrano krew z aorty brzusznej (w znieczuleniu izofluranem) do oznaczenia parametrów krzepnięcia oraz próbki kału do ekstrakcji DNA i sekwencjonowania 16S rRNA. Wszystkie zwierzęta uśmiercano po ostatniej dawce w 30. dniu.

Jakie zmiany hemostazy wywołał riwaroksaban?

Riwaroksaban spowodował dawko-zależną prolongację czasów krzepnięcia oraz redukcję fibrynogenu. W grupie kontrolnej (CGA) średnie wartości wynosiły: PT 11,58 ± 0,19 s, TT 33,83 ± 1,02 s, APTT 23,15 ± 0,37 s, FIB 1,53 ± 0,04 g/L. Grupa EGAL wykazała łagodne wydłużenie (PT 12,90 ± 0,75 s, TT 35,65 ± 0,43 s, APTT 26,28 ± 1,97 s, FIB 1,32 ± 0,19 g/L), podczas gdy grupy EGAM i EGAH osiągnęły wyraźnie silniejszy efekt antykoagulacyjny.

W grupie EGAM odnotowano PT 15,25 ± 0,38 s, APTT 37,50 ± 2,76 s oraz FIB 0,69 ± 0,05 g/L, natomiast w EGAH wartości te wynosiły odpowiednio: PT 16,60 ± 0,84 s, APTT 54,83 ± 6,75 s, FIB 0,58 ± 0,04 g/L. Wszystkie różnice były statystycznie istotne (q < 0,001), co potwierdza spójną odpowiedź farmakodynamiczną na riwaroksaban w modelu szczurzym.

Jak riwaroksaban wpłynął na skład mikrobioty jelitowej?

Sekwencjonowanie 16S rRNA zidentyfikowało łącznie 6145 jednostek taksonomicznych (OTU) przy progu podobieństwa 97%. Liczba OTU specyficznych dla grup wynosiła: 431 (CGA), 379 (EGAL), 501 (EGAM) i 665 (EGAH). Wskaźniki bogactwa (ACE/Chao1) wzrosły istotnie w grupach EGAM i EGAH w porównaniu z CGA i EGAL (q < 0,05), podczas gdy różnorodność mierzona wskaźnikami Shannona i Simpsona nie wykazała istotnych różnic między grupami.

Analiza beta-różnorodności (ANOSIM) wykazała istotne różnice w strukturze społeczności bakteryjnych między grupami (R = 0,665, p = 0,001), z większą niepodobnością między grupami niż wewnątrz grup. Analiza PCoA oparta na dystansach Bray–Curtis oraz UniFrac (ważony i nieważony) potwierdziła separację na poziomie grup, wskazując na zmiany składu mikrobioty wywołane ekspozycją na riwaroksaban.

Które bakterie uległy największym zmianom?

Na poziomie typu (phylum) Firmicutes pozostały dominujące we wszystkich grupach, ale ich względna obfitość wykazywała stopniowy spadek od małej do dużej dawki riwaroksabanu (CGA 97,16%, EGAL 99,49%, EGAM 91,68%, EGAH 90,98%; p < 0,01). Równolegle obserwowano wzrost Bacteroidota (CGA 1,75%, EGAL 0,15%, EGAM 4,30%, EGAH 4,97%; p < 0,01) oraz Proteobacteria (CGA 0,13%, EGAL 0,09%, EGAM 0,65%, EGAH 0,84%; p < 0,01).

Na poziomie rzędu (order) i rodziny (family) stwierdzono dawko-zależny spadek Erysipelotrichales i Lactobacillaceae. Erysipelotrichales zmniejszyły się z 12,95% (CGA) przez 5,29% (EGAL) do 0,59% (EGAM) i 0,50% (EGAH; p < 0,05). Lactobacillaceae wzrosły w EGAL (39,35%) w porównaniu z CGA (21,55%; p < 0,05), ale w wyższych dawkach ich obfitość nie różniła się istotnie od kontroli.

Na poziomie rodzaju (genus) Allobaculum wykazał najbardziej wyraźny spadek: z 11,92% (CGA) przez 4,22% (EGAL) do całkowitego zaniku w EGAM i EGAH (0,00%; p < 0,01). Podobnie Limosilactobacillus zmniejszył się w grupie EGAH (2,02%) w porównaniu z EGAL (6,57%; p < 0,05). Te taksony reprezentują linie bakteryjne wrażliwe na ekspozycję na riwaroksaban w tym modelu szczurzym.

Czy zmiany mikrobioty korelują z parametrami krzepnięcia?

Analiza korelacji Spearmana ujawniła istotne statystycznie związki między wybranymi taksonami a wskaźnikami hemostazy. Allobaculum wykazał ujemną korelację z APTT, PT i TT, ale dodatnią z fibrynogenem (FIB; q < 0,05). Oznacza to, że wyższa obfitość tego rodzaju wiązała się z krótszymi czasami krzepnięcia i wyższym poziomem fibrynogenu – czyli słabszym efektem antykoagulacyjnym.

Ligilactobacillus wykazał istotną ujemną korelację z FIB, podczas gdy jego korelacja z APTT, PT i TT była dodatnia, lecz nieistotna statystycznie. Inne rodzaje, w tym Limosilactobacillus, Lactobacillus oraz nieklasyfikowane Lachnospiraceae, wykazały słabe korelacje bez istotności statystycznej. Wyniki te sugerują, że Allobaculum może być wstępnym taksonem zainteresowania związanym ze zmianami krzepnięcia indukowanymi riwaroksabanem w tym modelu szczurzym, jednak obserwacja ta ma charakter eksploracyjny i wymaga dalszej walidacji mechanistycznej oraz klinicznej.

„Nasze wyniki pokazują, że różne dawki riwaroksabanu u szczurów są związane z dawko-zależnymi zmianami PT, APTT, TT i FIB, a także ze zmianami składu mikrobioty jelitowej” – piszą autorzy badania, podkreślając, że kilka taksonów bakteryjnych wykazało eksploracyjne związki z parametrami krzepnięcia, co sugeruje, że mikrobiota jelitowa może odzwierciedlać lub towarzyszyć efektom hemostatycznym riwaroksabanu w tym układzie doświadczalnym.

Jakie mechanizmy mogą tłumaczyć te obserwacje?

Rodzina Erysipelotrichaceae, do której należy Allobaculum, zawiera rodzaje takie jak Clostridium i Lachnoclostridium, powiązane z metabolizmem choliny dietetycznej i produkcją trimetyloaminy (TMA) – prekursora TMAO, metabolitu związanego ze zdarzeniami sercowo-naczyniowymi. Erysipelatoclostridium został również zidentyfikowany jako czynnik ryzyka migotania przedsionków. W obecnym badaniu obfitość Erysipelotrichaceae zmniejszała się wraz ze wzrostem dawki riwaroksabanu, co może sugerować potencjalnie korzystne przesunięcie mikrobioty.

Zgodnie z tymi obserwacjami, niedawne badanie na myszach wykazało, że riwaroksaban łagodzi zespół niedrożności zatokowej wątroby poprzez modulację mikrobioty jelitowej i odnotowało związek między obfitością Allobaculum w jelicie cienkim a podawaniem riwaroksabanu. Ligilactobacillus, który wykazał ujemną korelację z FIB, jest opisywany jako probiotyk zdolny do modulowania hiperkoagulacji poprzez produkcję krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), inhibicję TMAO i regulację immunologiczną.

Należy jednak podkreślić, że w badaniu tym zaobserwowano także nieoczekiwane zmiany w fibrynogenie i TT u szczurów otrzymujących riwaroksaban, które różnią się od raportów z osocza ludzkiego, gdzie terapeutyczny riwaroksaban typowo wydłuża PT (i w mniejszym stopniu APTT), ale wywiera niewielki lub żaden wpływ na fibrynogen metodą Claussa i TT przy stosowaniu standardowych odczynników. Różnice te mogą wynikać z kilku czynników: po pierwsze, eksperyment przeprowadzono na modelu szczurzym z 30-dniowym podawaniem riwaroksabanu raz dziennie, w tym w dawce supratherapeutycznej (18 mg/kg), co przypomina schematy stosowane w badaniach przedklinicznych nad efektami pleiotropowymi riwaroksabanu w modelach chorób przewlekłych, a nie standardowe dawkowanie kliniczne u ludzi.

Co te wyniki oznaczają dla klinicystów?

Badanie to ma charakter hipotezotwórczy i dostarcza wstępnych dowodów, że mikrobiota jelitowa może odzwierciedlać lub towarzyszyć zmianom hemostazy wywołanym riwaroksabanem. Nie udowadnia jednak, że modulacja mikrobioty jest przyczyną działania antykoagulacyjnego – obserwacje mają charakter asocjacyjny, a nie przyczynowo-skutkowy. Wyniki należy interpretować jako zmiany farmakodynamiczne i mikrobiomowe w tym modelu doświadczalnym, a nie jako bezpośrednią walidację relacji farmakokinetyczno-farmakodynamicznych riwaroksabanu u ludzi.

Potencjalni beneficjenci przyszłych badań klinicznych to pacjenci z migotaniem przedsionków i chorobami zakrzepowo-zatorowymi, u których obserwuje się nieoptymalne efekty terapii NOAC lub zwiększone ryzyko powikłań krwotocznych. Identyfikacja mikrobiomowych markerów odpowiedzi na riwaroksaban mogłaby w przyszłości umożliwić personalizację dawkowania lub interwencje dietetyczne/probiotyczne wspierające bezpieczeństwo terapii. Wymaga to jednak przeprowadzenia badań mechanistycznych (np. z użyciem zwierząt pozbawionych drobnoustrojów, gnotobiotycznych) oraz prospektywnych grup pacjentów z oceną metabolomiki, metagenomiki i parametrów farmakokinetycznych.

Czy zatem mikrobiota jelitowa może stać się celem interwencji w celu poprawy bezpieczeństwa terapii antykoagulacyjnej? Obecne dane nie pozwalają na jednoznaczną odpowiedź, ale otwierają nowy, obiecujący kierunek badań translacyjnych. Kluczowe będzie ustalenie, czy zmiany mikrobioty są przyczyną, skutkiem czy jedynie współzmienną zmienionych efektów hemostatycznych, a także czy obserwacje z modelu szczurzego można powtórzyć u pacjentów.

Jakie są główne ograniczenia tego badania?

Autorzy wymienili kilka istotnych ograniczeń. Po pierwsze, badanie przeprowadzono na modelu szczurzym z szerokim zakresem dawek riwaroksabanu, w tym dawkami supratherapeutycznymi, które mogą nie w pełni replikować mikrobioty jelitowej człowieka, stanu immunologicznego czy farmakokinetyki; dlatego wyniki nie powinny być bezpośrednio ekstrapolowane na standardowe dawkowanie kliniczne. Po drugie, zastosowano jedynie sekwencjonowanie 16S rRNA, co ogranicza rozdzielczość funkcjonalną; podejścia metagenomiczne i metabolomiczne są potrzebne do wyjaśnienia mechanistycznych powiązań między funkcjami drobnoustrojów a fenotypami krzepnięcia.

Po trzecie, nie mierzono stężeń riwaroksabanu w osoczu czy kale, więc nie można było ustalić ilościowych relacji farmakokinetyczno-farmakodynamicznych ani jelitowej ekspozycji na lek. Obserwacje należy zatem interpretować jako hipotezotwórcze i wymagają walidacji w większych badaniach na zwierzętach oraz grupach ludzkich. Po czwarte, ocena przekrojowa w jednym punkcie czasowym wyklucza wnioskowanie przyczynowe dotyczące kierunkowości związków między dawką riwaroksabanu, mikrobiotą jelitową a parametrami krzepnięcia; dane nie pozwalają rozróżnić, czy zmiany mikrobiologiczne są przyczyną, skutkiem czy jedynie korelatem zmienionych mechanizmów hemostazy.

Czy mikrobiota jelitowa może wpływać na skuteczność i bezpieczeństwo riwaroksabanu?

Badanie to wykazało, że różne dawki riwaroksabanu u szczurów wiążą się z dawko-zależnymi zmianami PT, APTT, TT i fibrynogenu oraz ze zmianami składu mikrobioty jelitowej. Kilka taksonów bakteryjnych – zwłaszcza Allobaculum i Ligilactobacillus – wykazało eksploracyjne związki z parametrami krzepnięcia, co sugeruje, że mikrobiota jelitowa może odzwierciedlać lub towarzyszyć efektom hemostatycznym riwaroksabanu w tym układzie doświadczalnym.

Obserwacje te mają jednak charakter korelacyjny i nie dowodzą, że zmiany mikrobioty przyczynowo pośredniczą w odpowiedziach antykoagulacyjnych. Dalsze eksperymenty mechanistyczne (w tym badania na zwierzętach gnotobiotycznych) oraz badania kliniczne są niezbędne do wyjaśnienia przyczynowości, zdefiniowania leżących u podstaw szlaków i oceny translacyjnego znaczenia sygnatur mikrobiomowych dla bezpieczeństwa antykoagulantów i odpowiedzi na leczenie. Identyfikacja mikrobiomowych biomarkerów odpowiedzi na riwaroksaban mogłaby w przyszłości umożliwić personalizację terapii u pacjentów z migotaniem przedsionków i chorobami zakrzepowo-zatorowymi, ale droga od modelu szczurzego do praktyki klinicznej wymaga jeszcze wielu kroków walidacyjnych.