Linagliptyna z rywaroksabanem przeciwko rakowi szyjki macicy

Czy leki nienowotworowe mogą skutecznie zwalczać raka szyjki macicy?

Rak szyjki macicy pozostaje czwartym najczęstszym nowotworem złośliwym wśród kobiet na świecie, szczególnie w krajach o niskich i średnich dochodach, gdzie dostęp do skutecznych programów przesiewowych i szczepień przeciwko HPV jest ograniczony. Mimo że wczesne wykrywanie poprzez cytologię i testy HPV znacząco zmniejszyło zachorowalność w krajach o rozwiniętych systemach opieki zdrowotnej, globalne nierówności w dostępie do prewencji i leczenia stanowią poważne wyzwanie zdrowia publicznego.

Chemioradioterapia z wykorzystaniem cisplatyny pozostaje standardem postępowania, jednak wiąże się z istotnymi ograniczeniami: systemową toksycznością, nefrotoksycznością, mielosupresją i zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi, które pogarszają jakość życia pacjentek i ograniczają skuteczność terapii. Te negatywne konsekwencje podkreślają pilną potrzebę poszukiwania bezpieczniejszych alternatyw terapeutycznych.

Badacze z Iraku podjęli próbę identyfikacji skutecznego leczenia poprzez wykorzystanie kombinacji leków pierwotnie opracowanych do innych celów terapeutycznych. Ich uwagę przyciągnęły linagliptyna (inhibitor DPP-4 stosowany w cukrzycy typu 2) oraz rywaroksaban (doustny antykoagulant), które w badaniach przedklinicznych wykazały potencjalne właściwości przeciwnowotworowe. Wybór tych leków oparto na obszernych badaniach farmakokinetycznych, korzystnych profilach bezpieczeństwa oraz udokumentowanej aktywności przeciwnowotworowej.

Jakie mechanizmy molekularne mogą tłumaczyć działanie przeciwnowotworowe?

Linagliptyna w badaniach przedklinicznych wykazała zdolność do hamowania proliferacji komórek nowotworowych i indukcji apoptozy poprzez modulację kluczowych szlaków sygnałowych, takich jak PI3K/AKT i ERK, niezbędnych dla przeżycia i wzrostu guza. Ponadto hamuje angiogenezę poprzez obniżenie ekspresji czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Dodatkowym mechanizmem może być wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej poprzez zwiększenie aktywności komórek NK i limfocytów T cytotoksycznych.

Rywaroksaban, poza swoim podstawowym działaniem antykoagulacyjnym, może hamować progresję nowotworów poprzez wpływ na zakrzepicę związaną z nowotworem, która jest powiązana ze wzrostem guza i przerzutami. Badania wskazują, że zmniejsza ekspresję czynnika prozapalnego i proangiogennego – czynnika tkankowego (TF) oraz VEGF, ograniczając w ten sposób angiogenezę i zdolność do tworzenia przerzutów. Może również bezpośrednio wpływać na przeżywalność komórek nowotworowych poprzez indukcję apoptozy i hamowanie proliferacji z udziałem szlaku PI3K/AKT.

Kluczowym elementem badania było zbadanie zdolności mieszanki do celowania w zmutowane białka kinaz szlaku sygnałowego MAPK-RAS. Szlak ten kontroluje proliferację komórkową, różnicowanie i przeżycie, a jego zaburzenia są charakterystyczne dla wielu nowotworów. Mutacje w genach RAS (KRAS, NRAS, HRAS) lub receptorach takich jak EGFR prowadzą do stałej aktywacji kaskady MAPK (RAF, MEK, ERK), co skutkuje niekontrolowaną proliferacją komórek. Ta nadmierna aktywacja promuje rozwój nowotworu poprzez przyspieszenie cyklu komórkowego, hamowanie apoptozy oraz wspieranie angiogenezy i przerzutów.

Jak przeprowadzono badanie skuteczności mieszanki?

Badanie przeprowadzono metodą in vitro z wykorzystaniem linii komórkowej HeLa (pochodzącej z raka szyjki macicy) oraz NHF (prawidłowych komórek tkanki tłuszczowej) jako kontroli. Linagliptynę i rywaroksaban uzyskano z irackiej fabryki farmaceutycznej jako surowce. Substancje rozcieńczono w podłożu MEM, tworząc zakres stężeń od 0,1 do 1000 μg/ml dla każdego leku oraz ich mieszanki w proporcji 1:1.

Cytotoksyczność oceniano testem MTT po 24 i 72 godzinach inkubacji. Metoda ta opiera się na zdolności żywych komórek do redukcji żółtego barwnika MTT do fioletowych kryształów formazanu przez dehydrogenazy mitochondrialne. Ilość powstałego formazanu, mierzona spektrofotometrycznie przy długości fali 570 nm, jest wprost proporcjonalna do liczby żywych komórek. Obliczano połowę maksymalnego stężenia hamującego (IC₅₀) oraz procent zahamowania wzrostu komórek.

Indeks selektywnej toksyczności (SI) obliczono jako stosunek IC₅₀ dla linii komórek zdrowych do IC₅₀ dla komórek nowotworowych. Wartość SI>1,0 wskazuje na większą skuteczność leku wobec komórek nowotworowych w porównaniu z jego toksycznością dla komórek prawidłowych. Dodatkowo przeprowadzono analizy wskaźnika kombinacji (CI) oraz wskaźnika redukcji dawki (DRI) przy użyciu oprogramowania Compusyn, aby ocenić charakter interakcji między składnikami mieszanki (synergizm, addytywność, antagonizm).

Badania molekularne obejmowały symulacje dockingowe z wykorzystaniem AutoDock Tools, BIOVIA Discovery Studio oraz UCSF Chimera. Struktury chemiczne linagliptyny i rywaroksabanu przygotowano w ChemDraw i zoptymalizowano w Chem3D. Struktury molekularne zmutowanego p38 MAPK (PDB: 5o8u) oraz zmutowanego RAS (PDB: 7l0f) pobrano z bazy Protein Data Bank. Analizowano energie wiązania (scoring dockingowy) oraz rodzaje interakcji między ligandami a białkami docelowymi.

Jakie wyniki cytotoksyczności uzyskano dla poszczególnych leków?

Linagliptyna wykazała zdolność do redukcji proliferacji komórek raka szyjki macicy w sposób zależny od stężenia i czasu inkubacji. IC₅₀ obniżyło się z 1861,5 μg/ml po 24 godzinach do 1252,6 μg/ml po 72 godzinach. Przy najwyższym stężeniu (1000 μg/ml) zahamowanie wzrostu komórek wyniosło 30,3% po 24 godzinach i 44% po 72 godzinach (p<0,05).

Rywaroksaban również wykazał właściwości antyproliferacyjne zmieniające się wraz z czasem inkubacji. IC₅₀ zmniejszyło się z 2024,8 μg/ml (24 godz.) do 1239,7 μg/ml (72 godz.). Krzywa zależności dawka-odpowiedź dla rywaroksabanu była nieliniowa, co może sugerować dwufazową odpowiedź związaną z hormetycznym działaniem substancji. Przy niskich dawkach mogą być aktywowane mechanizmy ochronne komórek (naprawa DNA, odpowiedź antyoksydacyjna), podczas gdy wysokie dawki powodują uszkodzenie DNA i niestabilność genomową.

Cisplatyna, użyta jako kontrola pozytywna, wykazała IC₅₀ wynoszące 1280,8 μg/ml (24 godz.) oraz 904,7 μg/ml (72 godz.) dla linii HeLa. Dla linii NHF wartości te wyniosły odpowiednio 1037,9 μg/ml i 598,4 μg/ml, co wskazuje na niską selektywność cisplatyny wobec komórek nowotworowych.

Mieszanka linagliptyny z rywaroksabanem wykazała najsilniejsze działanie cytotoksyczne: IC₅₀ = 805,3 μg/ml (24 godz.) oraz 579 μg/ml (72 godz.) dla linii HeLa. Co istotne, dla linii NHF wartości IC₅₀ były znacznie wyższe: 4541,7 μg/ml (24 godz.) i 2956,1 μg/ml (72 godz.), co potwierdza wysoką selektywność mieszanki wobec komórek nowotworowych.

Czy składniki mieszanki działają synergistycznie?

Analiza wskaźnika kombinacji (CI) przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Compusyn wykazała, że interakcja między linaglityną a rywaroksabanem ma charakter synergistyczny, szczególnie w określonych warunkach. Po 24 godzinach inkubacji mieszanka wykazała bardzo silny synergizm przy stężeniach 0,1, 1, 100 i 1000 μg/ml (CI<1), podczas gdy przy stężeniu 10 μg/ml obserwowano silny synergizm.

Po 72 godzinach inkubacji wzorzec interakcji był bardziej złożony: przy stężeniach 0,1 i 1 μg/ml obserwowano antagonizm (CI>1), przy 10 μg/ml umiarkowany synergizm, a przy 100 i 1000 μg/ml bardzo silny synergizm. Ta zmienność sugeruje, że charakter interakcji zależy zarówno od stężenia substancji, jak i czasu ekspozycji, co może być związane z różnymi fazami cyklu komórkowego, na które wpływają poszczególne składniki.

Wskaźnik redukcji dawki (DRI) wykazał, że stężenia leków w mieszance wymagane do wywołania cytotoksyczności były niższe niż w przypadku stosowania substancji pojedynczo. Po 24 godzinach redukcja była obserwowana dla większości stężeń (z wyjątkiem najniższych dla rywaroksabanu), a po 72 godzinach szczególnie przy stężeniach 5,50 i 500 μg/ml dla obu leków. DRI>1 oznacza korzystną redukcję stężenia, co sugeruje, że mieszanka może być stosowana w niższych dawkach przy zachowaniu skuteczności, potencjalnie zmniejszając ryzyko działań niepożądanych.

Jakie mechanizmy molekularne ujawnił docking komputerowy?

Symulacje dockingowe ujawniły, że linagliptyna wykazuje wysokie powinowactwo do zmutowanego p38 MAPK (PDB: 5o8u) z energią wiązania wynoszącą -7,9 kcal/mol. Analiza interakcji wykazała pięć konwencjonalnych wiązań wodorowych z resztami aminokwasowymi ASN A:159, LYS A:165, ARG A:49 oraz dwiema LEU A:108, a także wiązania typu pi-kation, pi-pi-T-shaped oraz wiązania alkilowe. Dla porównania, ralimetinib – standardowy inhibitor p38 MAPK – wykazał energię wiązania -8,7 kcal/mol, co wskazuje, że linagliptyna ma zbliżone, choć nieco niższe powinowactwo.

Rywaroksaban natomiast wykazał silne powinowactwo do zmutowanej kinazy RAS (PDB: 7l0f) z energią wiązania wynoszącą -8,7 kcal/mol, co było wyższe niż dla sotorasibu (-6,2 kcal/mol) – standardowego inhibitora RAS. Interakcje obejmowały konwencjonalne wiązania wodorowe z ASN A:116, wiązania węglowo-wodorowe, pi-sigma, pi-sulfur oraz wiązania alkilowe i pi-alkilowe z różnymi resztami aminokwasowymi.

Te wyniki sugerują, że mieszanka działa poprzez podwójny mechanizm celowania: linagliptyna hamuje zmutowany p38 MAPK, podczas gdy rywaroksaban blokuje zmutowaną kinazę RAS. Oba cele są kluczowymi elementami szlaku sygnałowego MAPK-RAS, którego dysregulacja jest charakterystyczna dla wielu nowotworów, w tym raka szyjki macicy. Komplementarność mechanizmów działania wyjaśnia zaobserwowany synergizm cytotoksyczny mieszanki.

Co to oznacza dla praktyki klinicznej i przyszłych badań?

Wyniki badania wskazują, że mieszanka linagliptyny z rywaroksabanem może stanowić obiecującą alternatywę lub uzupełnienie dotychczasowych metod leczenia raka szyjki macicy. Kluczowe zalety to: (1) wysoka selektywność wobec komórek nowotworowych (SI=5,1), (2) synergistyczne działanie składników pozwalające na redukcję dawek, (3) korzystny profil bezpieczeństwa wynikający z wieloletniego stosowania obu leków w innych wskazaniach oraz (4) podwójny mechanizm działania celujący w zmutowane formy p38 MAPK i RAS.

Szczególnie istotne jest to, że oba leki posiadają dobrze poznaną farmakokinetykę i profile bezpieczeństwa, co może przyspieszyć ich ewentualną translację do zastosowań klinicznych w ramach repositioningu lekowego. Linagliptyna jest szeroko stosowana w leczeniu cukrzycy typu 2, a rywaroksaban w profilaktyce i leczeniu powikłań zakrzepowo-zatorowych. Ich bezpieczeństwo zostało potwierdzone w licznych badaniach klinicznych i wieloletnim stosowaniu u milionów pacjentów na świecie.

Głównym ograniczeniem badania jest jego charakter in vitro oraz brak walidacji wyników w modelach zwierzęcych i badaniach klinicznych. Badania molekularne oparte na symulacjach komputerowych wymagają eksperymentalnego potwierdzenia. Autorzy sami przyznają, że przeszkody finansowe uniemożliwiły im przeprowadzenie walidacji laboratoryjnej wyników dockingowych.

Konieczne są dalsze badania in vivo na modelach zwierzęcych raka szyjki macicy, aby ocenić skuteczność mieszanki, jej farmakokinetykę, biodostępność oraz profil bezpieczeństwa w warunkach ustrojowych. Dopiero pozytywne wyniki takich badań mogłyby uzasadnić przeprowadzenie badań klinicznych u pacjentek z rakiem szyjki macicy. Warto również zbadać potencjał mieszanki w innych typach nowotworów, w których szlak MAPK-RAS odgrywa kluczową rolę, takich jak rak trzustki, jelita grubego czy płuca.

Czy repositioning leków może zrewolucjonizować terapię raka szyjki macicy?

Badanie wykazało, że kombinacja linagliptyny z rywaroksabanem skutecznie hamuje proliferację komórek raka szyjki macicy in vitro, wykazując wyższą cytotoksyczność niż cisplatyna oraz synergistyczne działanie składników. Indeks selektywnej toksyczności (SI=5,1) potwierdza preferencję mieszanki wobec komórek nowotworowych, co stanowi istotną przewagę nad standardową chemioterapią. Analiza molekularna ujawniła nowatorski mechanizm działania poprzez podwójne celowanie w zmutowane formy p38 MAPK i kinazy RAS – kluczowych elementów szlaku sygnałowego MAPK-RAS.

Z perspektywy bezpieczeństwa, możliwość stosowania niższych dawek (potwierdzona wskaźnikiem DRI) oraz znane profile farmakokinetyczne i toksykologiczne obu leków zwiększają atrakcyjność tej strategii terapeutycznej. Repositioning istniejących leków do nowych wskazań, w tym przypadku z cukrzycy i kardiologii do onkologii, może znacząco skrócić czas i koszty rozwoju nowych terapii. Jednak translacja tych obiecujących wyników do praktyki klinicznej wymaga przeprowadzenia badań in vivo oraz odpowiednio zaprojektowanych badań klinicznych.

Koncepcja wykorzystania leków nienowotworowych w terapii raka nie jest nowa, ale niniejsze badanie dostarcza konkretnych dowodów na skuteczność i mechanizmy działania mieszanki linagliptyna–rywaroksaban. Jeśli kolejne etapy badań potwierdzą te wyniki, może to otworzyć nową drogę w leczeniu raka szyjki macicy, szczególnie w krajach o ograniczonym dostępie do drogich terapii celowanych. Dla lekarzy onkologów i ginekologów-onkologów wyniki te mogą stanowić punkt wyjścia do przemyślenia strategii terapeutycznych oraz potencjalnego udziału w przyszłych badaniach klinicznych.