Nanotechnologia rewolucjonizuje terapię chorób sercowo-naczyniowych

Czy nowoczesne terapie rewolucjonizują leczenie chorób sercowo-naczyniowych?

Choroby sercowo-naczyniowe (CVD) stanowią główną przyczynę zgonów na świecie. Według danych Światowej Organizacji Zdrowia z 2019 roku, z powodu CVD zmarło 17,9 miliona osób, co stanowiło 32% globalnej śmiertelności. Prognozy wskazują na możliwy wzrost tej liczby do 25 milionów w niedalekiej przyszłości. Wśród najważniejszych chorób sercowo-naczyniowych znajdują się udar mózgu, żylna choroba zakrzepowo-zatorowa (VTE) oraz hiperlipidemia. VTE znacząco przyczynia się do globalnej śmiertelności z powodu CVD, powodując zatory w żyle płucnej i zakrzepicę żył głębokich (DVT). Tradycyjnie stosowane w profilaktyce przeciwzakrzepowej heparyna i antagoniści witaminy K wiążą się z częstymi działaniami niepożądanymi, takimi jak trombocytopenia, osteoporoza i krwawienia wewnętrzne, co znacząco zawęża ich okno terapeutyczne. Dodatkowo, interakcje lekowe i pokarmowe ograniczają skuteczność terapeutyczną tych konwencjonalnych leków. W odpowiedzi na te problemy FDA zatwierdziła terapię bezpośrednimi doustnymi antykoagulantami, w tym riwaroksabanem (RIVA), edoksabanem, dabigatranem i apiksabanem.

Riwaroksaban charakteryzuje się szybkim, zależnym od stężenia efektem hamującym na czynnik Xa (FXa). Zapobiega przekształceniu protrombiny (czynnik II) w trombinę (czynnik IIa) poprzez odwracalne wiązanie z miejscami S1 i S4 FXa, co hamuje tworzenie się skrzepów fibrynowych. W porównaniu do konwencjonalnych opcji terapeutycznych, RIVA wykazuje bardziej przewidywalną farmakokinetykę (PK) i farmakodynamikę (PD), co wzbudziło zainteresowanie badaczy jego zastosowaniem terapeutycznym i profilaktycznym. Dotychczas zgłoszono stosunkowo niewiele interakcji lekowych. Opracowano różne systemy dostarczania RIVA, w tym tabletki, hydrożele, mikrosfery i kompleksy polimerowe. W tych badaniach omówiono niektóre ograniczenia RIVA, takie jak niska biodostępność, jednak pominięto inne istotne problemy, w tym nefrotoksyczność, hepatotoksyczność i incydenty krwotoczne, które utrudniają uzyskanie pożądanego działania farmakologicznego. Istnieje zatem potrzeba opracowania ukierunkowanego systemu dostarczania leku, który przezwyciężyłby te ograniczenia, poprawił parametry farmakokinetyczne, zwiększył skuteczność terapeutyczną i zminimalizował profil toksyczności.

Czy nanotechnologia otwiera nowe możliwości w dostarczaniu leku?

Nanotechnologia odgrywa kluczową rolę w przezwyciężaniu ograniczeń związanych z konwencjonalnymi systemami dostarczania leków. Ostatnio opisano kilka nanosystemów mających na celu rozwiązanie problemów związanych z substancjami farmaceutycznymi. Należą do nich nanocząstki lipidowe stałe (SLN), nośniki nanolipidowe (NLC), transferosomy, transetosomy, nanocząstki polimerowe, liposomy i dyspersje stałe. Ukierunkowane systemy dostarczania leków oparte na nanotechnologii odgrywają ważną rolę w poprawie parametrów farmakokinetycznych i farmakodynamicznych oraz zmniejszaniu profilu toksyczności. Ponadto, systemy dostarczania leków oparte na nanonoścnikach są zwykle bardziej stabilne fizykochemicznie. NLC oferują kilka zalet, które czynią je preferowanym wyborem dla przedłużonego uwalniania. Na przykład, NLC chronią lek przed degradacją w trudnym środowisku przewodu pokarmowego, zapewniając stabilność leku. Co więcej, zapewniają kontrolowany profil uwalniania, umożliwiając przedłużone uwalnianie leku przez dłuższy czas. Ponadto, matryca lipidowa w NLC może zwiększać rozpuszczalność i absorpcję leków słabo rozpuszczalnych w wodzie, prowadząc do lepszej biodostępności. NLC mają również lepszą wydajność pułapkowania w warunkach przechowywania w porównaniu do innych nanonoścników. Są one zwykle przygotowywane poprzez dostosowanie odpowiedniego stosunku lipidów stałych, lipidów ciekłych i surfaktantów, aby uzyskać maksymalną wydajność pułapkowania i wykazać optymalne zachowanie kontrolowanego uwalniania. Nośniki NLC mogą być podawane drogą doustną, doodbytniczą, dożylną, dootrzewnową, donosową i miejscową.

W tym badaniu przygotowano RIVA-NLC przy użyciu metody homogenizacji wysokoobrotowej w celu zmniejszenia rozmiaru cząstek oraz poprawy profilu uwalniania i farmakokinetyki słabo rozpuszczalnych leków, zmniejszając tym samym ich potencjał toksyczności poprzez serię eksperymentów. NLC zostały szczegółowo zbadane pod kątem właściwości cząstek, charakterystyki stanu stałego i morfologii. Przeprowadzono badania uwalniania in vitro przygotowanych RIVA-NLC i porównano je z zawiesiną RIVA, a następnie określono procent hemolizy i żywotność komórek opracowanej formulacji w celu oceny czasu protrombinowego i profilu toksyczności wprowadzonego leku. Ponadto przeprowadzono badanie in vivo na szczurach Sprague-Dawley w celu określenia biofarmaceutycznych właściwości RIVA-NLC w porównaniu z czystym lekiem. Przeprowadzono również czteromiesięczne badania stabilności RIVA-NLC zgodnie z wytycznymi Międzynarodowej Konferencji Harmonizacji (ICH). Według najlepszej wiedzy autorów, takie badanie nie zostało dotychczas przeprowadzone.

Materiały użyte w badaniu obejmowały riwaroksaban (RIVA), kwas stearynowy i kwas oleinowy zakupione od Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Tween 80 został zakupiony od Merck (Darmstadt, Niemcy). Membrana dializacyjna została uzyskana od Spectrum Laboratories, Inc. (Los Angeles, CA USA). Komórki ludzkiej nerki embrionalnej (HEK) 293 zostały pozyskane z Dr. Panjwani Center for Molecular Medicine and Drug Research (PCMD), Karachi, Pakistan. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), płodowa surowica bydlęca, penicylina i streptomycyna zostały zakupione od Sigma Aldrich (Dallas, TX, USA). Wszystkie pozostałe chemikalia były klasy badawczej i zostały użyte bez dalszego oczyszczania.

Badania na zwierzętach przeprowadzono na samcach szczurów Sprague-Dawley (waga: 280 ± 10 g; wiek: 6 ± 1 tydzień) uzyskanych z Riphah International University, Islamabad, Pakistan. Zwierzęta były trzymane w standardowym obiekcie z odpowiednimi warunkami temperatury i wilgotności wynoszącymi odpowiednio 24 ± 2°C i 56 ± 3% przed rozpoczęciem eksperymentów przez 5-7 dni zgodnie z “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Eighth Edition”. Standardowa karma dla zwierząt i woda pitna były dostarczane, aby utrzymać szczury zdrowe, zadowolone i nawodnione. Badania in vivo przeprowadzono zgodnie z ARRIVE (wersja 2), zatwierdzonymi przez komitet bioetyczny (BIC) Quaid-i-Azam University, Islamabad, Pakistan z numerem zatwierdzenia QAU/FBS/2022-381.

Nanocząstki lipidowe zawierające riwaroksaban (RIVA-NLC) przygotowano metodą mikroemulsji. Najodpowiedniejsze lipidy i surfaktanty zostały wybrane na podstawie ich wartości HLB do opracowania NLC załadowanych lekiem (RIVA). Różne lipidy stałe, w tym kwas stearynowy, Compritol, monostearynian glicerolu, wosk pszczeli, tricaprylina, tripalmityna i palmitynian izopropylu są zwykle używane w przygotowaniu NLC. Podobnie, różne surfaktanty, takie jak tween 80, span 80, span 20, cremophor A6 i tween 65 są zwykle używane. W tym przypadku, RIVA-NLC przygotowano przy użyciu kwasu stearynowego i tween 80 ze względu na ich odpowiednie wartości HLB. Zastosowanie kwasu oleinowego jako lipidu ciekłego powoduje kruchość w rdzeniu lipidowym, co pozwala na enkapsulację większej ilości leku w sieci. Z tego powodu kwas oleinowy został użyty do przygotowania RIVA-NLC wraz z kwasem stearynowym.

Różne ilości RIVA (10-100 mg), kwasu stearynowego (80-300 mg) i kwasu oleinowego (20-300 mg) dokładnie odważono i stopiono w temperaturze 80°C. Jednocześnie wodę destylowaną (1 ml) i Tween-80 (5-30 mg) rozpuszczono oddzielnie w zlewce w temperaturze 80°C za pomocą mieszadła magnetycznego. Fazę wodną rozprowadzono w fazie organicznej za pomocą mieszadła magnetycznego przez 60 minut w tej samej temperaturze, aby uzyskać preemulsję. Preemulsję następnie homogenizowano za pomocą homogenizatora IKA® Ultra-turrrax przy 9000 obr/min przez 10 minut. Ostatecznie, dyspersję RIVA-NLC przygotowano przez zmieszanie preemulsji (utrzymywanej w temperaturze 80°C) z schłodzoną wodą destylowaną (utrzymywaną w temperaturze 2-3°C) w stosunku objętościowym 1:9.

Charakterystyka nanocząstek RIVA-NLC obejmowała analizę średniego rozmiaru cząstek, indeksu polidyspersyjności i potencjału zeta za pomocą Zetasizera (ZS 90, Malvern, UK). Dokładnie, 10 µL próbki rozcieńczono 1 mL wody dejonizowanej w jednorazowej kuwecie, a następnie wymieszano w wytrząsarce przez 1 minutę dla odpowiedniej homogenizacji. Analiza wielkości została przeprowadzona w jednorazowej kuwecie. Potencjał zeta został określony za pomocą uniwersalnej celki zanurzeniowej Zetasizera. Próbki były badane w trzech powtórzeniach.

Wydajność inkorporacji leku została określona przy użyciu metody pośredniej z pewnymi modyfikacjami. Dokładnie, 0,1 mL RIVA-NLC zmieszano z 9,9 mL etanolu i sonikowano przez 3 minuty, a następnie wirowano przez 60 minut przy 12 000 obr/min. Po wirowaniu przygotowano dyspersję supernatantu (1 mL) i mieszaniny acetonitrylu i wody destylowanej (2 mL; stosunek objętościowy 55:45) do analizy HPLC w celu ilościowego oznaczenia leku. Przed ilościowym oznaczeniem sporządzono 7-punktową krzywą standardową RIVA w zakresie 0,0195-2,5 µg/mL, a odpowiedź była liniowa w całym zakresie z R² = 0,999. Ponadto, dolna granica oznaczalności (LLOQ) wynosiła 0,0195 µg/mL, podczas gdy różnice wewnątrz dnia i między dniami mieściły się w odpowiednich granicach (R² = 0,997). HPLC był wyposażony w kolumnę C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm), autosampler (SIL-10AD) i detektor UV-Vis (SPD-10A). Ponadto, do oddzielania niepotrzebnych gazów z próbki użyto degazera (DGU-20A5). Faza ruchoma składała się z acetonitrylu i podwójnie destylowanej wody w stosunku objętościowym 55:45. Próbkę 20 µL z szybkością przepływu 1 mL/min przez 15 minut poddano analizie leku. Analiza została przeprowadzona przy 260 nm, a temperatura kolumny była utrzymywana na poziomie 35°C.

Jak ocenić jakość i efektywność RIVA-NLC?

Morfologiczne cechy RIVA-NLC zostały określone za pomocą TEM (Hitachi; Tokio, Japonia). Dokładnie, 100 µL próbki załadowano na siatkę pokrytą węglem z następnym podaniem 2% roztworu kwasu fosfowolframowego w celu wykonania barwienia negatywnego. Próbki suszono w piecu w temperaturze 40°C przez 24 godziny przed analizą. Rozdzielczość TEM została ustawiona na 0,2 nm dla sieci i 0,36 nm dla badania obrazu cząstek. Analiza została przeprowadzona przy przyspieszonym napięciu 100 kV.

Badania DSC i XRD przeprowadzono w celu porównawczej oceny właściwości termicznych i krystalicznych czystego leku, lipidu, ich mieszaniny fizycznej i RIVA-NLC. W związku z tym odnotowano interakcje i zachowania leku i jego składników. Przed tym próbkę liofilizowano za pomocą systemu liofilizatora Dura-Dry MP/Dura-Stop MP (SP Scientific, Warminster, PA). Liofilizowane RIVA-NLC przechowywano w eksykatorze do czasu użycia w charakterystyce stanu stałego.

DSC (NC, Delaware USA) użyto do określenia właściwości termicznych leku i jego odpowiedników w NLC. Dokładnie odważoną próbkę 5000 µg umieszczono w aluminiowej miseczce i zamknięto aluminiową pokrywą. Pusta aluminiowa miseczka została użyta jako odniesienie i umieszczona w odpowiednim miejscu w DSC. Suchy azot o przepływie 30 mL/min był używany przez całą analizę. Temperatura systemu była utrzymywana między (50-250°C) przez stałe zwiększanie temperatury o 10°C/minutę.

XRD (Rigaku, Tokio, Japonia) użyto do analizy struktury krystalicznej RIVA, kwasu stearynowego, mieszaniny fizycznej i RIVA-NLC. Parametry XRD zostały dostosowane przy wzroście 1° na sekundę, a całkowita ścieżka została ustawiona na 1° ≤ 2θ ≤ 50°. Ponadto, napięcie ustawiono na 40 kV, a prąd utrzymywano na poziomie 100 mA, jak wcześniej zgłaszano.

Technikę dyfuzji przez membranę dializacyjną zastosowano do określenia uwalniania in vitro RIVA z RIVA-NLC i zawiesiny. Przed rozpoczęciem eksperymentu membranę dializacyjną zanurzono w medium uwalniającym na pół godziny. Do tego badania użyto aparatu do rozpuszczania USP II (Vision 1 classic 6TM Hanson Research Co., Chatsworth CA, USA). Jako medium uwalniające wykorzystano podwójnie destylowaną wodę (900 mL) o utrzymywanej temperaturze 37°C. Prędkość mieszadła ustawiono na 100 obr/min. W tym badaniu dla obu próbek testowych użyto ilości równoważnej 10 mg RIVA. W określonych odstępach czasu (15 min, 30 min, 1 h, 2, 4, 6, 12 i 24 h) pobierano 2 mL próbki do ilościowego oznaczenia leku, po czym następowało zastąpienie równą objętością medium rozpuszczającego w celu utrzymania warunków sink. Do oddzielenia nierozpuszczonych części próbki użyto filtrów nylonowych o wielkości 450 nm. Następnie próbkę analizowano metodą HPLC, jak omówiono powyżej.

Dane o skumulowanym uwalnianiu dopasowano do różnych modeli matematycznych, tj. modelu zerowego rzędu, pierwszego rzędu, Higuchiego, Korsmeyera-Peppasa, Hixona-Crowella i Weibulla, aby ocenić kinetykę uwalniania leku. Modele wybrano, aby wyjaśnić potencjalny mechanizm uwalniania leku. Do oceny dopasowania każdego modelu wykorzystano parametry statystyczne, takie jak współczynnik determinacji (R²), kryterium informacyjne Akaike (AIC) i kryteria wyboru modelu (MSC). Model o wyższym R², niskim AIC i wyższym MSC został wybrany jako najbardziej odpowiedni model do wyjaśnienia mechanizmu uwalniania leku.

Czy innowacyjne metody gwarantują bezpieczeństwo i skuteczność terapii?

Potencjał hemolityczny in vitro opracowanych RIVA-NLC został przeanalizowany i porównany z zawiesiną RIVA. Oddzielnie zebrano cytratowane świeże próbki krwi od pięciu zdrowych ochotników przy użyciu metody aseptycznej. BIC zatwierdził udział ochotników ludzkich (numer zatwierdzenia QAU/FBS/2022-381), którzy oddali 10 mL swojej krwi do analizy hemolitycznej in vitro. Osady erytrocytów zebrano przez wirowanie próbek krwi przy 28 000 obr/min przez 10 minut. Osady były rozmazywane trzy razy, a następnie ponownie rozproszone w PBS (pH 7,4). W tym momencie formulację załadowaną lekiem i zawiesinę erytrocytów umieszczono w buforze o następujących stężeniach przez 120 minut: 75, 50, 25, 12,5, 6,25 i 3,125 μg/mL w termomieszadle Eppendorf (Hamburg, Niemcy) z temperaturą utrzymywaną na poziomie 37,5 ± 1°C. Eksperyment przeprowadzono za zgodą ASTM F756-00 (Standard Practice for Assessment of Hemolytic Properties of Materials) (ASTM 2013). RBC zebrano przez wirowanie próbki przy 12 000 obr/min przez 6 minut po zawieszeniu ich w buforze przez 120 minut. Do sprawdzenia gęstości optycznej (OD) supernatantu użyto czytnika mikropłytek (EXL 800™, BIO-TEK®, USA). Analizę przeprowadzono przy długości fali 540 nm. Jako kontrolę pozytywną użyto Triton X-100 (1%, w/v).

Do analizy cytotoksycznej formulacji wykorzystano komórki 293 Human Embryonic Kidney (HEK) pozyskane z Dr. Panjwani Center (Karachi, Pakistan). DMEM z dodatkiem 10% inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej, 4,5 mg/mL glukozy, 0,1 mg/mL penicyliny i 0,14 mg/mL streptomycyny użyto do przygotowania linii komórkowych. Temperatura inkubacji była utrzymywana na poziomie 37 ± 0,5°C z 95:5% tlenem i dwutlenkiem węgla. Następnie roztwór trypsyny-EDTA użyto do subkultywacji co 2 dni.

Dwanaście samców szczurów Sprague-Dawley podzielono na dwie grupy z równą liczbą szczurów w każdej grupie. Izofluran użyto do uspokojenia szczurów przed rozpoczęciem eksperymentu, zgodnie z wytycznymi American Veterinary Medical Association (AVMA) Guidelines for the Euthanasia of Animals (2020). Szczury przymocowano do deski sekcyjnej za pomocą nici, tak że leżały twarzą do góry. Przeprowadzono niewielki zabieg chirurgiczny w celu wprowadzenia wstępnie heparynizowanej rurki polietylenowej do tętnicy udowej, a do pobierania próbek krwi w określonych czasach użyto kranu z 3-stronnymi zamkami. Każdego szczura zważono i na podstawie ich wagi podano 10 mg/kg RIVA. Na przykład, 0,966 mL RIVA-NLC (1 mL zawierał 3 mg leku) podano szczurowi ważącemu 280 mg za pomocą igły żołądkowej. Jednej partii szczurów podano RIVA-NLC, a drugiej partii podano zawiesinę RIVA (10 mg/kg; 3 mg szczurowi ważącemu 280 mg) drogą doustną. Około 280 µl próbki krwi pobrano w każdym predefiniowanym przedziale czasowym, a osocze oddzielono przez wirowanie krwi przy 12 000 obr/min przez 15 minut. Próbki przechowywano w -20°C przed ilościowym oznaczeniem RIVA.

W celu ilościowego oznaczenia leku, osocze wyjęto z lodówki i trzymano w temperaturze pokojowej, aż się stopiło. Osocze (145 µL) dodano do równej ilości ACN, który już miał rozpuszczone 10 µL wzorca wewnętrznego (acetaminofen; 50 µg/mL); następnie wirowano jak omówiono wcześniej. Pomaga to w inklinacji białek z osocza. Supernatant (20 µL) analizowano pod kątem zawartości leku za pomocą HPLC, jak omówiono wcześniej.

Do badania profilu farmakokinetycznego, w tym pola pod krzywą (AUC)₀~nieskończoność, stałej szybkości eliminacji (Kel) i okresu półtrwania (t₁/₂) użyto oprogramowania WinNonlin (wersja 5.2; Pharsight, Mountain View, USA). Ponadto, stężenie RIVA w osoczu obliczono przy użyciu maksymalnego stężenia leku i czasu potrzebnego do osiągnięcia maksymalnego stężenia leku u każdego szczura.

Dane w całym manuskrypcie uznano za znacząco różne dla wartości p mniejszych niż 0,05. Ponadto, do określenia statystycznego znaczenia ocenianych formulacji użyto testów t-Studenta, testów ANOVA jednokierunkowej i testów Kaushal Wallisa. Całe dane określono przy użyciu średniej ± S.D. (n = 3) dla badań in vitro, podczas gdy analizę farmakokinetyczną in vivo przeprowadzono w sześciu zestawach.

Jak zoptymalizować formulację i stabilność nanocząstek?

Stabilność RIVA-NLC badano zgodnie z International Conference of Harmonization (ICH) Topic Q 1A (R2), która wspiera badania stabilności nowych substancji i produktów leczniczych. RIVA-NLC oceniano pod kątem wielkości cząstek, PDI, potencjału zeta i wydajności pułapkowania. Próbki przechowywano w temperaturze utrzymywanej między 4°C a 40°C z wahaniami ± 2°C, aby przeprowadzić badania stabilności. Próbki oceniano w momencie przygotowania oraz w odstępach 1, 2, 4 i 6 miesięcy dla wymienionych wcześniej warunków. Każdą próbkę oceniano w trzech powtórzeniach.

Nanotechnologia została ostatnio zbadana pod kątem rozwoju systemów dostarczania leków, które mogą zmieniać podstawowe właściwości leków, osiągać uwalnianie specyficzne dla miejsca, poprawiać biodostępność, zapewniać ukierunkowane dostarczanie i zwiększać potencjał terapeutyczny włączonych leków. Co więcej, może poprawić skuteczność i bezpieczeństwo urządzeń medycznych i nośników oraz zmniejszyć cytotoksyczność leków. Dlatego w tym badaniu przygotowaliśmy nośniki nanolipidowe (NLC) riwaroksabanu (RIVA), aby poprawić jego rozpuszczanie, potencjał hemolityczny i biodostępność.

NLC są dyspersjami formulowanymi przez zmieszanie lipidów stałych, lipidów ciekłych i środków powierzchniowo czynnych za pomocą odpowiedniej techniki. Technika mikroemulsji jest najbardziej odpowiednia, ponieważ jest łatwa, wydajna i może być wykonana za pomocą ogólnych urządzeń laboratoryjnych, podczas gdy inne metody są drogie, mają problemy ze stabilnością formulacji i wymagają złożonych urządzeń laboratoryjnych. Dlatego metoda mikroemulsji została użyta do przygotowania NLC o identycznych rozmiarach cząstek oraz odpowiednim rozkładzie wielkości i stabilności. Lipidy i emulgatory wybrano na podstawie kryterium ich wartości HLB. Wcześniej zgłaszano, że wartości HLB lipidów i surfaktantów powinny być identyczne, aby uzyskać idealne właściwości fizykochemiczne systemów opartych na lipidach. Wartości HBL składników RIVA-NLC okazały się być w zakresie 15-16 dla kwasu stearynowego, co było identyczne z wartością HLB Tween 80. Tak więc, RIVA-NLC sformułowano z różnymi ilościami leku (RIVA), lipidu stałego (kwas stearynowy), lipidu ciekłego (kwas oleinowy) i surfaktantu (Tween 80). Składniki formulacji wybrano na podstawie optymalnych właściwości cząstek i wydajności pułapkowania.

Znacząco poprawiony średni rozmiar cząstek i wydajność pułapkowania można zaobserwować przy zwiększonym stężeniu kwasu stearynowego. Zwiększony rozmiar cząstek może wynikać z obecności ogromnej ilości lipidu, podczas gdy zwiększona wydajność pułapkowania może być przypisana wysokiej lipofilności RIVA. Wcześniej zaświadczono, że zwiększone stężenie lipidu zwiększa średni rozmiar cząstek. Początkowo ten wzrost nie jest znacząco różny, jednak po dodaniu większych ilości lipidów można zaobserwować znaczący wzrost. Podobnie, dostępność większej ilości lipidów może prowadzić do włączenia dodatkowej ilości leku do rdzenia lipidowego, prowadząc do zwiększonej wydajności pułapkowania. Ponadto, w innym zestawie eksperymentów, gdy zwiększono ilość surfaktantu, zaobserwowano zmniejszone średnie rozmiary cząstek formulacji. Chociaż wydajność pułapkowania była początkowo znacząco zwiększona, powyżej pewnego stężenia surfaktantu (45 mg) różnica stała się nieistotna.

Potencjał zeta odgrywa ważną rolę w zapobieganiu aglomeracji cząsteczek i utrzymaniu stabilności elektrostatycznej w formulacjach. Wcześniej zgłaszano, że dyspersje koloidalne z wartościami potencjału zeta ± 30 mV wykazywały stabilność elektrostatyczną i steryczną. Eksperymentalnie, potencjał zeta RIVA-NLC wynosił między -20 a -30, co jest optymalnym zakresem potencjału zeta dla nanostrukturalnych nośników lipidowych. Podobnie, dane indeksu polidyspersyjności wskazywały na równomierne rozłożenie cząstek w formulacji. Optymalny zakres wartości polidyspersyjności wynosi między 1 a 0,001. Im niższa wartość polidyspersyjności, tym bardziej cząstki są rozłożone w systemie. Wartość polidyspersyjności powyżej 1 wskazuje na tworzenie się cząstek o wysokiej gęstości, prowadząc do ostatecznej niestabilności układu koloidalnego. W tym badaniu wszystkie przygotowane RIVA-NLC miały wartości PDI w zakresie od 0,42 do 0,11, demonstrując tworzenie identycznych rozmiarów cząstek i stabilnego systemu NLC. Może to wynikać z optymalizowanych lipidów i surfaktantów podczas procesu selekcji, prowadząc do akceptowalnej grubości warstwy dyfuzyjnej, co ostatecznie skutkuje unikaniem akumulacji cząstek.

Czy zaawansowane techniki analityczne potwierdzają efekty formulacji?

Analiza TEM wykazała, że cząstki były równomiernie rozmieszczone, okrągłe z określoną warstwą zewnętrzną i monodyspersyjne w całej formulacji. Ten wynik dodatkowo potwierdził ustalenia zetasizera, które wykazały, że formulacja miała optymalny rozmiar cząstek i dystrybucję.

Analiza DSC czystego RIVA, kwasu stearynowego, mieszaniny fizycznej i RIVA-NLC wykazała wyraźny pik endotermiczny RIVA przy 229°C, podczas gdy stosunkowo niższy pik obserwowano dla kwasu stearynowego przy 69°C. Te dane pokazały kompleksowe topnienie RIVA w ustalonych okolicznościach, osiągając jednocześnie temperaturę przejścia szklistego dla kwasu stearynowego. Odpowiednio, mieszanina fizyczna wykazała stosunkowo zredukowany reprezentatywny pik RIVA i niezmieniony pik kwasu stearynowego. Te wyniki pokazują, że w mieszaninach fizycznych właściwości termiczne tych związków nie zmieniają się znacząco, tym samym utrzymując swoje zachowanie termiczne. Z drugiej strony, w RIVA-NLC zaobserwowano zanik pików endotermicznych RIVA i kwasu stearynowego, wskazując na zmiany właściwości końcowej formulacji po przekształceniu w NLC.

RIVA-NLC, lipid, czysty lek i mieszanina fizyczna zostały przeanalizowane za pomocą PXRD, a ich wykresy krystaliczności pokazano na rysunku. Rysunek ilustruje krystaliczną strukturę czystego leku mającego główne piki przy 9,1°, 13,4°, 15,6°, 18,2°, 19,7°, 23,1°, 25,0° i 27,4° w zakresie 2-theta, pokazując systematyczną strukturę krystaliczną. Lipid wykazał kilka wyraźnych pików w różnych pozycjach, w tym 18,5°, 29,3° i 22,4° w zakresie 2-theta, wykazując nieznaczną strukturę krystaliczną. Mieszanina fizyczna wykazała wyraźne odpowiednie piki dla leku i lipidu. Struktura krystaliczna RIVA pozostała nienaruszona w mieszaninie fizycznej, nawet jeśli została zmieszana szpatułką. To wzmacnia hipotezę, że krystaliczność RIVA może być zmniejszona, jeśli zostanie przetworzona przez techniki przygotowania nanocząstek lub przez właściwe wykorzystanie stosunku lipidu i surfaktantu. Ponadto, produkcja nanocząstek może skutkować wysokim stosunkiem powierzchni do objętości, co może prowadzić do wzrostu energii powierzchniowej, tym samym prowadząc do tworzenia struktur amorficznych. Krystalografia RIVA-NLC nie wykazała pików RIVA i kwasu stearynowego w ich odpowiednich pozycjach, potwierdzając zmianę krystalicznego leku w lek amorficzny. Te wyniki pokazują, że RIVA, gdy zostaje włączona do RIVA-NLC, przechodzi przez utratę krystaliczności, tym samym przekształcając się w formę amorficzną, co może skutkować poprawą rozpuszczalności i wybitnej biodostępności.

Badanie uwalniania in vitro wykazało znacznie zwiększony profil uwalniania z RIVA-NLC w każdym punkcie czasowym, wskazując na potencjał NLC do poprawy uwalniania leku. W szczególności, 44% całkowitej ilości leku zostało uwolnione przez RIVA-NLC w ciągu pierwszych 4 godzin, 78% całkowitej ilości leku zostało uwolnione w ciągu 12 godzin, a około 96% całkowitej ilości leku zostało uwolnione w ciągu 24 godzin. Natomiast znacznie zmniejszona ilość RIVA została uwolniona z zawiesiny: tylko 4,7% leku zostało uwolnione w ciągu 2 godzin, następnie 10,1% i 13,13% uwolnione w ciągu 12 i 24 godzin. Wyniki tego badania ujawniły, że RIVA-NLC mają sześciokrotnie zwiększone uwalnianie w porównaniu do zawiesin RIVA. Ten znaczący wzrost rozpuszczania RIVA z RIVA-NLC może wynikać z koloidalnej natury leku w NLC. Ponadto, doskonałe włączenie i przekształcenie krystaliczności leku w formę amorficzną mogą być innymi zauważalnymi powodami poprawy rozpuszczalności. Oprócz tego, matryca lipidowa NLC, składająca się zarówno z lipidu stałego, jak i ciekłego, zapewnia stabilne środowisko dla leku, tym samym ułatwiając przedłużone uwalnianie leku.

Stosując różne modele kinetyczne do danych uwalniania, model Korsmeyera-Peppasa okazał się najlepiej dopasowanym modelem. Model ten wykazał silną korelację między przewidywanymi a obserwowanymi danymi uwalniania, co było oczywiste z wyższego R². Dodatkowo, model ten zapewnił doskonałą równowagę między złożonością modelu a dobrym dopasowaniem, co można potwierdzić niższą wartością AIC. Ponadto, wyższość dopasowania do danych eksperymentalnych została zweryfikowana przez wyższą wartość MSC. Wartość wykładnika uwalniania wynosiła 0,43, oznaczając dyfuzję Ficka jako mechanizm uwalniania. To wykazało, że dyfuzja leku z matrycy lipidowej była głównym mechanizmem uwalniania leku z formulacji REVA-NLC. Wcześniej zgłaszano, że mechanizm uwalniania leku z zaawansowanych formulacji leków, takich jak NLC, może być przypisany dyfuzji leku, w której lek dyfunduje z matrycy nośnika w odpowiedzi na gradient stężenia. Podobne wyniki zaobserwowano w naszych przygotowanych NLC.

Czy RIVA-NLC to przełom w terapii chorób sercowo-naczyniowych?

Wyniki badania stabilności pokazały, że średni rozmiar cząstek pozostał niezmieniony (147 nm i 154 nm) w warunkach przechowywania w 4°C i 40°C. Podobnie, PDI nie uległ znaczącej zmianie, ponieważ jego wartości pozostały na poziomie 0,110 w obu temperaturach przechowywania po 6 miesiącach badania. Jeśli chodzi o potencjał zeta, jego wartości odnotowano jako -26,1 mV i -26,6 mV odpowiednio dla 4 i 40°C w porównaniu z potencjałem zeta (-29,4 mV) świeżej formulacji. Wydajność inkorporacji RIVA-NLC wynosiła 93% i 92% w obu warunkach przechowywania w temperaturze 4°C i 40°C. Podobnie, formulacja pozostała fizycznie stabilna przez cały okres badania w obu warunkach przechowywania. To badanie wykazało zdolność NLC do pozostawania stabilnymi przez co najmniej 6 miesięcy. Może to wynikać z doskonałego potencjału lipidów stałych i ciekłych do utrzymania leku w nienaruszonym stanie i pomocy w utrzymaniu integralności nanocząstek z pomocą surfaktantów.

Aktywność hemolityczna RIVA-NLC była testowana w ludzkich erytrocytach przy różnych stężeniach (przyspieszających podwójnie od 3,125 do 75 μg/mL) i porównana z zawiesiną RIVA. Badanie to wykazało możliwą interferencję między RIVA-NLC a błonami komórkowymi RBC. Ta interakcja była niezbędna do określenia, ponieważ lek w czystej postaci prowadzi do chemicznego lub mechanicznego impulsywnego zniszczenia RBC, prowadząc do uwolnienia hemoglobiny. Maksymalny ułamek hemolityczny RIVA-NLC stwierdzono przy 50 i 75 μg/mL, które odnotowano odpowiednio jako 4,7 i 5,3 μg/mL. Przy wszystkich innych stężeniach potencjał hemolityczny był nawet niższy od wyżej wymienionych wartości. Podobnie, puste NLC nie powodowały żadnej hemolizy ze względu na brak RIVA w nich. Ponadto, inne składniki NLC również nie wykazywały żadnego potencjału hemolitycznego. W przeciwieństwie do RIVA-NLC, zawiesina RIVA spowodowała prawie 90% hemolizę przy 3,125 μg/mL i około 100% hemolizę przy wszystkich innych testowanych stężeniach, wskazując na ciężką i znacznie zwiększoną hemolizę ludzkich erytrocytów. Wcześniej zgłaszano, że formulacja jest uważana za niemającą aktywności hemolitycznej, o ile wykazuje poniżej 5% hemolizy w ludzkich erytrocytach. Nasze wyniki wykazały, że RIVA-NLC nie mają istotnego profilu hemolitycznego, podkreślając ich doskonałą ochronę przy wszystkich stężeniach z wyjątkiem 100 μg/mL. Z drugiej strony, wartości procentowe hemolizy zawiesiny RIVA były niezwykle wysokie nawet przy najmniejszych stężeniach, wskazując na poważny potencjał hemolityczny czystego leku. Z tych wyników można wywnioskować, że RIVA może nie powodować żadnej hemolizy, gdy jest włączona do NLC. Możliwymi przyczynami mogą być biokompatybilne lipidy użyte w przygotowaniu NLC, które są mniej prawdopodobne, aby powodować niepożądane reakcje z czerwonymi krwinkami (RBC), jak wcześniej zgłaszano. Podobnie, matryca lipidowa tworzy barierę ochronną wokół leku, tym samym zapobiegając bezpośredniej interakcji z błonami RBC i unikając hemolizy. Innym możliwym powodem może być kontrolowane uwalnianie leku z NLC, co zmniejsza szanse na wysokie lokalne stężenia leku, tym samym zmniejszając szanse na uszkodzenie RBC.

Linie komórkowe HEK zostały użyte do sprawdzenia potencjalnej cytotoksyczności RIVA-NLC przy użyciu testu redukcji MTT. Wyniki badania żywotności komórek RIVA-NLC, zawiesiny RIVA i pustych NLC wykazały, że podobnie jak puste NLC, RIVA-NLC wykazały lepszą żywotność komórek (96%) i potwierdziły profile bezpieczeństwa formulacji. Z drugiej strony, zawiesina RIVA wykazała 50% hemolizę przy stężeniu do 20 μg/mL oraz około 80% i 100% hemolizę przy 50 μg/mL i 75 μg/mL w teście MMT. Zgodnie z ISO 10993:5, wartość graniczna dla próbki, aby była uważana za toksyczną dla komórek HEK, wynosi 70% lub poniżej. Nasze wyniki sugerują również bezpieczeństwo RIVA-NLC dla tkanek nerek, ponieważ profil żywotności komórek przekraczał 96%. Podobnie, puste NLC z 99% żywotnością komórek nie wykazały szkodliwych tendencji. Jednak zawiesina RIVA, ze względu na swój potencjał cytotoksyczny, może powodować poważne zakłócenia tkanek, ponieważ wykazała zmniejszenie żywotności komórek znacznie powyżej progu przy wszystkich stężeniach. Wcześniej stwierdzono również, że około 67% podanej dawki RIVA jest wydalane w niezmienionej postaci przez drogę nerkową. Ten zmniejszony profil toksyczności RIVA-NLC może zapobiec uszkodzeniu tkanki nerkowej, zapobiegając ogólnoustrojowym szkodliwym skutkom leku. Ustalenia te mogą wymagać dalszej oceny za pomocą zaawansowanych technik dla nefrotoksyczności.

Profile farmakokinetyczne RIVA-NLC i zawiesiny RIVA badano u szczurów. Zaobserwowano znacznie zwiększoną biodostępność (9,01-krotnie) RIVA z RIVA-NLC w porównaniu z zawiesiną RIVA. Na przykład, zaobserwowano znacznie poprawione (6344 ± 456 ng/mL) maksymalne stężenie (Cmax) RIVA z RIVA-NLC w porównaniu z Cmax (967,42 ± 33,19 ng/mL) zawiesiny RIVA. Podobnie, więcej czasu (Tmax; 2,43 h) było potrzebne dla RIVA-NLC do uzyskania Cmax w porównaniu z Tmax zawiesiny RIVA (1,51 h), wskazując na znaczne zmniejszenie Tmax, co może prowadzić do zatrzymania RIVA w krwiobiegu z zachowaniem przedłużonego uwalniania. Ponadto, AUC RIVA-NLC było znacząco zwiększone (19367,43 ± 3148,12 ng.h/mL) w porównaniu z AUC zawiesiny RIVA (2148,51 ± 291,63 ng.h/mL). Okres półtrwania (t1/₂) RIVA-NLC był również znacząco poprawiony w porównaniu z zawiesiną RIVA. Jednak wartości Kel dla obu testowanych formulacji pozostały niezmienione. Dane farmakokinetyczne ogólnie reprezentują znaczenie RIVA-NLC pod względem ich lepszej biodostępności. Ponadto, NLC wykazały kontrolę nad uwalnianiem leku z poprawionym okresem utrzymywania, co może zwiększyć wynik terapeutyczny załadowanego leku. Można więc stwierdzić, że znacznie poprawiona biodostępność RIVA wystąpiła, gdy została włączona do NLC. Ponadto, znacząco poprawione wartości parametrów farmakokinetycznych RIVA-NLC wykazały zdolność NLC do dostarczania leku do krwiobiegu z przedłużonym uwalnianiem i poprawioną regulacją uwalniania leku. Te poprawione parametry farmakokinetyczne mogą wynikać z zwiększonego rozpuszczania i biodostępności RIVA, gwarantując kontrolowane uwalnianie RIVA po podaniu doustnym. Dodatkowo, mały rozmiar cząstek NLC pozwala na lepszą absorpcję przez błony biologiczne, tym samym zwiększając biodostępność leku. Wcześniej zgłaszano, że NLC mogą ułatwiać transport leków przez układ limfatyczny, omijając metabolizm pierwszego przejścia w wątrobie, który często zmniejsza biodostępność doustnie podawanych leków. Ponadto, NLC zapewniają stabilne środowisko dla leku, chroniąc go przed degradacją i zapewniając kontrolowane uwalnianie. Biodegradowalna i biokompatybilna natura lipidów używanych w NLC również czyni je odpowiednimi do dostarczania leków bez powodowania niepożądanych skutków. Ponadto, toksyczność farmakokinetyczna związana z tym lekiem może być również zminimalizowana dzięki mechanizmowi kontroli NLC, jak wykazano w różnych badaniach przeprowadzonych w tym projekcie.

W tym badaniu RIVA-NLC zostały z powodzeniem przygotowane do podawania doustnego z poprawioną biodostępnością i bezpieczeństwem. Optymalna formulacja składała się z RIVA, kwasu stearynowego, kwasu oleinowego, tween 80 i podwójnie destylowanej wody w ich odpowiednich stosunkach 30:120:80:25:10 w/v. RIVA-NLC wykazały idealną morfologię nanocząsteczkową, rozmiar i wydajność inkorporacji. Charakterystyka stanu stałego ujawniła konwersję krystalicznego leku w lek amorficzny, co zostało dodatkowo potwierdzone przez zwiększone uwalnianie RIVA z RIVA-NLC. Rozpuszczanie RIVA zostało znacznie zwiększone po włączeniu do NLC w porównaniu z zawiesiną RIVA. Ponadto, bezpieczeństwo leku zostało ustalone podczas podawania w RIVA-NLC, co zaobserwowano podczas analiz hemolitycznych in vitro i cytotoksyczności. Wreszcie, biodostępność RIVA została znacznie zwiększona po włączeniu do NLC z zwiększonym AUC, Cmax i Tmax w porównaniu z zawiesiną RIVA. Można stwierdzić, że NLC są potencjalnym systemem dostarczania leków, który może być stosowany do zwiększenia biodostępności i zmniejszenia zdolności hemolizy i cytotoksyczności RIVA.

Podsumowanie

Badania nad nowoczesnymi terapiami chorób sercowo-naczyniowych koncentrują się na wykorzystaniu nanotechnologii w celu poprawy skuteczności i bezpieczeństwa leków przeciwzakrzepowych. Opracowane nośniki nanolipidowe riwaroksabanu (RIVA-NLC) wykazują znaczące zalety w porównaniu do konwencjonalnych form leku. RIVA-NLC charakteryzują się optymalnym rozmiarem cząstek, wysoką wydajnością inkorporacji leku oraz stabilnością. Badania potwierdziły przekształcenie krystalicznej formy leku w amorficzną, co przyczyniło się do zwiększonego uwalniania substancji czynnej. Analizy in vitro i in vivo wykazały znacznie niższą cytotoksyczność oraz potencjał hemolityczny RIVA-NLC w porównaniu do zawiesiny riwaroksabanu. Biodostępność leku w formie nanocząstek była 9-krotnie wyższa, z lepszymi parametrami farmakokinetycznymi. Technologia ta może stanowić przełom w terapii chorób sercowo-naczyniowych, oferując skuteczniejsze i bezpieczniejsze leczenie.